實(shí)驗(yàn)一 α-淀粉酶活力的測(cè)定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/font>1. 掌握測(cè)定α-淀粉酶活力的原理; 2. 學(xué)習(xí)并掌握測(cè)定α-淀粉酶活力的實(shí)驗(yàn)操作。 二、實(shí)驗(yàn)原理α-淀粉酶能將淀粉分子鏈中α-1,4葡萄糖苷鍵隨機(jī)切斷成長(zhǎng)短不一的短鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖,而使淀粉對(duì)碘呈藍(lán)紫色的特異性反應(yīng)逐漸消失,呈紅棕色,其顏色消失的速度和酶活力有關(guān),可通過(guò)固定反應(yīng)后的吸光度計(jì)算其酶活力。 酶活力的定義:1g固體酶粉(或1mL液體酶),于60℃、pH=6.0條件,1h液化1g可溶性淀粉,即為1個(gè)酶活力單位,以u/g(u/mL)表示。 三、實(shí)驗(yàn)器材1. 實(shí)驗(yàn)材料:所購(gòu)α-淀粉酶的固體酶粉 2. 試劑及溶液 (1)原碘液 稱取碘(I2)11g、碘化鉀(KI)22g,用少量水使碘完全溶解,然后定容至500mL,貯于棕色瓶中。 (2)稀碘液 吸取原碘液2.00mL,加碘化鉀20g,用水溶解并定容至500mL,貯于棕色瓶中。 (3) 20g/L可溶性淀粉溶液 稱取可溶性淀粉(以絕干計(jì))2.000g,精確至0.001g,用水調(diào)成漿狀物,在攪動(dòng)下緩緩傾入70mL沸水中,然后,以30mL水分幾次沖洗裝淀粉的燒杯,洗液并入其中,加熱至完全透明,冷卻,定容至100mL,此溶液需要當(dāng)天配制。 (4)磷酸緩沖液(pH=6.0) 稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)45.23g、檸檬酸(C6H8O7·H2O)8.07g,用水溶解定容至1000mL。配好后用pH計(jì)校正。 3. 儀器和設(shè)備 (1)分光光度計(jì) 應(yīng)符合GB9721的有關(guān)規(guī)定 (2)恒溫水浴(60±0.2)℃。 (3)秒表 (4)試管 25mm×200mm 四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 待測(cè)酶液的制備 稱取酶粉1~2g,精確至0.0002g(或吸取液體酶1.00mL),先用少量的磷酸緩沖液溶解,并用玻璃攪拌棒搗研,將上清液小心傾入容量瓶中,沉渣部分再加入少量緩沖液,如此搗研3~4次,最后全部移入容量瓶中,用緩沖液定容至刻度(將估計(jì)酶活力除以4,即酶活力應(yīng)在3.7~5.6u/mL范圍內(nèi)),搖勻。通過(guò)4層紗布過(guò)濾,濾液供測(cè)定用。(此溶液需要當(dāng)天配制) 2. 測(cè)定 (1) 吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于試管中,加入緩沖液5.00mL,搖勻后,于(60±0.2)℃恒溫水浴中預(yù)熱5min。(小三角瓶中進(jìn)行) (2)加入稀釋好的待測(cè)酶液1.00mL,立即記時(shí),搖勻,準(zhǔn)確反應(yīng)5min。 (3)立即吸取反應(yīng)液1.00 mL于稀碘液5.00 mL中,搖勻,并以稀碘液作空白,于660nm波長(zhǎng)下,用10mm比色皿,迅速測(cè)定其吸光度(A)。根據(jù)其吸光度查附表,求得測(cè)試酶液的濃度(c)。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算公式: X= c ×n 式中,X――樣品的酶活力(u/g,或u/mL) c――測(cè)試酶液的濃度(u/mL) n――樣品的稀釋倍數(shù) 所得結(jié)果表示至整數(shù)。 2. 平行試驗(yàn)相對(duì)誤差不得超過(guò)2%。 實(shí)驗(yàn)二 蛋白酶活性的測(cè)定一,目的要求 學(xué)會(huì)蛋白酶活性的測(cè)定方法. 二,實(shí)驗(yàn)原理 蛋白酶在一定的溫度與pH條件下,水解酪素底物,產(chǎn)生含有酚基的氨基酸,在堿性條件下,將福林試劑還原,生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán),用分光光度法測(cè)定. 三,儀器,材料與試劑 1,苯酚試劑加水稀釋1倍左右,用NaOH標(biāo)定至1mol/L使用.盛在有色瓶中保存. 2,10%三氯醋酸溶液 3,0.4mol/L碳酸鈉溶液:稱取42.4g無(wú)水碳酸鈉,用水溶解,定容至1 000mL. 4,適當(dāng)pH緩沖液(供不同蛋白質(zhì)使用):例如0.02mol/L,pH7.5磷酸緩沖液. 5,2%酪蛋白溶液:稱取酪蛋白2g,用少量0.5mol/LNaOH溶液濕潤(rùn)后,用各種酶適宜的緩沖液稀釋,在沸水液中加熱溶解,冷卻后用相應(yīng)的緩沖液定容至100mL. 6,0.1%標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液:準(zhǔn)確稱取酪氨酸(預(yù)先在105°C干燥2h)0.1g,用0.2mol/L HCl溶解并定容至100mL.使用時(shí)再稀釋成不同濃度. 四,實(shí)驗(yàn)步驟 1,將標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液配成0~100ug/mL的各種不同溶液.分別吸收1mL,各加入0.4mol/LNa2CO3溶液5mL及福林試劑1mL,置于40°C顯色15min,分別測(cè)定OD680,以酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo),OD680為坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線. 2,取酶液1mL,預(yù)熱至40°C,加入預(yù)熱的2%酪蛋白溶液1mL,于40°C反應(yīng)10min,反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入10%三氯醋酸溶液2mL,立即搖勻,靜置10min后過(guò)濾.取濾液1mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)相同的步驟,測(cè)定OD680.空白實(shí)驗(yàn)時(shí),先加三氯醋酸溶液,然后再加入底物和酶液,同樣測(cè)定OD680. 3,計(jì)算 在上述條件下,每分鐘催化酪蛋白水解生成1mg酪氨酸的酶量定義為1個(gè)活力單位. 酶活力(單位)= OD680 x Kx n /10 式中: OD680——在680nm波長(zhǎng)下,樣品測(cè)定與空白實(shí)驗(yàn)的光密度差; K——常數(shù),有標(biāo)準(zhǔn)曲線得出,數(shù)值上等于OD680為1的時(shí)候所相當(dāng)?shù)睦野彼岬暮量藬?shù); n——反應(yīng)液體積; 10——反應(yīng)時(shí)間為10min. 實(shí)驗(yàn)三、纖維素(CMC)酶活力的測(cè)定方法 一、 原理 纖維素酶在一定的溫度和pH條件下,將纖維素底物(CMC,羧甲基纖維素鈉)水解,釋放出還原糖。在堿性、煮沸條件下,能將3,5-二硝基水楊酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物,其顏色的深淺與還原糖(以葡萄糖計(jì))含量成正比。通過(guò)其在550nm測(cè)其吸光度,可得到還原糖生成量,計(jì)算出β-葡聚糖酶的酶活力。以此代表纖維素(CMC)酶的總酶活力。 酶活單位定義 在(40±0.2)℃、pH 4.2條件下,在1min內(nèi)水解羧甲基纖維素鈉底物,產(chǎn)生相當(dāng)于1微克葡萄糖的還原糖的酶量,為1個(gè)酶活單位,以u(píng)/g(u/ml)表示。 二、 試劑和溶液 除非另有規(guī)定,試驗(yàn)中所用試劑均為分析純,所用水為蒸餾水或去離子水。 i. 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 中國(guó)醫(yī)藥公司上?;瘜W(xué)試劑公司產(chǎn),分析純,在25℃,2%水溶液粘度300~800厘泊爾。 ii. 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液: 甲液:稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4.2H2O )35.61 g, 用蒸餾水溶解,并定容至1000ml。 乙液:稱取檸檬酸(C6H8O7.H2O)21.01 g,用蒸餾水溶解,并定容至1000ml。. 使用溶液:取甲液414ml,加乙液586ml混合均勻,用pH計(jì)校正至pH為(4.2 ±0.05),備用。 iii. 1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液 稱取1g羧甲基纖維素鈉,精確至1mg,緩緩加入pH為4.2 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液80ml,水浴加熱至全部溶解。冷卻后用2M HCL或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH到(4.2 ±0.05),攪拌均勻,定容至100ml,再用二層紗布過(guò)濾。此溶液在4oC冰箱貯存,有效期為3天。 iv. 3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑: 取酒石酸鉀鈉182g,溶于500ml蒸餾水中,加熱。于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3g, 氫氧化鈉10g,苯酚5g,無(wú)水亞硫酸鈉5g,攪拌至溶,冷卻后用蒸餾水定容至1000ml,混勻,過(guò)濾,貯于棕色試劑瓶中,于暗處放置1周后使用。 :注:在黑色或棕色瓶中于室溫下貯存,該試劑最多穩(wěn)定6個(gè)月。 v. 1%(W/V)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液 稱取預(yù)先于(103±2)℃下干燥至恒重的葡萄糖1.0000 g,用蒸餾水溶解后定容至100 ml,即為1%濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。 D.2.5葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液 分別吸取1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、 5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中,加蒸餾水至刻度,搖勻,制成每ml分別含葡萄糖200μg、400μg、600μg、800μg、1000μg、1200 μg的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。 b) 儀器和設(shè)備 除普通實(shí)驗(yàn)室儀器外,還應(yīng)有: i. 恒溫水浴鍋(40±0.2) oC。 D.3.2 分光光度計(jì) ii. 酸度計(jì) 精度±0.01pH 。 iii. 分析天平 感量0.1mg。 iv. 秒表或定時(shí)鐘。 c) 測(cè)定步驟 i. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按表D.1,分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于各管中(每管號(hào)平平行3個(gè)樣),混勻。 將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于沸水浴中,反應(yīng)7min,取出,迅速冷卻至室溫,準(zhǔn)確加入蒸餾水10ml,混勻。用10mm比色杯,以空白管(對(duì)照液)調(diào)儀器零點(diǎn),在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm處測(cè)吸光度。以葡萄糖量為橫座標(biāo),以吸光度為縱座標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得線性回歸方程。線性回歸系數(shù)(r)應(yīng)在0.9990以上時(shí)方可使用(否則須重做)。對(duì)每個(gè)新配制的DNS溶液制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 表D.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 管 號(hào)
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1
2
3
4
5
6 ii. 樣品的測(cè)定 1. 待測(cè)酶液的制備 固體酶:根據(jù)樣品酶活大小,稱取2g-10g固體酶樣,精確至0.1mg,加入40-200ml蒸餾水,溶解后置40oC水浴浸提30min,用濾紙過(guò)濾,再根據(jù)樣品酶活性大小,二次稀釋至適宜濃度(使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間,下同)。液體酶:精確量取液體酶若干ml,根據(jù)樣品酶活力大小,直接用蒸餾水稀釋至適宜濃度,待測(cè)。 2. 操作程序 ――取三支18×180mm試管(一支空白管。二支樣品管)。 ――分別向三支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液0.50ml 。 ――將三支試管放入(40±0.2)oC水浴中預(yù)熱5min,同時(shí)將測(cè)定底物(1%羧甲基纖維素鈉溶液)置同一溫度水浴中預(yù)熱5min。 ――分別向二支樣品管中加入1.5ml 1%羧甲基纖維素鈉溶液,向空白管中加入3mlDNS試劑,準(zhǔn)確計(jì)時(shí),反應(yīng)10min,取出。 ――迅速、準(zhǔn)確向二支樣品管中加入3ml DNS試劑,于空白管中加入1.5ml 1%羧甲基纖維素鈉溶液,搖勻。將三支試管同時(shí)放入沸水浴中,待水浴中的水重新沸騰時(shí)開(kāi)始準(zhǔn)確計(jì)時(shí),反應(yīng)7min,取出,迅速冷卻至室溫。向三支試管中各加入10ml蒸餾水,混勻。 ――以空白管(對(duì)照液)調(diào)儀器零點(diǎn),在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm下,用10mm比色杯,分別測(cè)二支樣品管中樣液的吸光度,取平均值。通過(guò)查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量。 d) 酶活力計(jì)算 按照下式(D.1)計(jì)算樣品的纖維素CMC酶的活力: A×V×N X1= …………………………………………………(D.1) 0.5×W×10 式中: X1――――纖維素CMC酶活力,u/g??; A――――根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得(或從回歸方程計(jì)算出)的還原糖生成量,μg; V――――樣品提取時(shí)加入水的量(ml); N――――樣品二次稀釋時(shí)的稀釋倍數(shù); 0.5―――參與反應(yīng)的酶量(ml); W――――樣品重量(g); 10――――反應(yīng)時(shí)間(min)。 e) 精密度 同一試樣兩次測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值,不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。 |