酶制劑實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

李-磊 · 發(fā)表于 2012-6-26 18:51:52

實(shí)驗(yàn)一 α-淀粉酶活力的測(cè)定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/font>

1. 掌握測(cè)定α-淀粉酶活力的原理；

2. 學(xué)習(xí)并掌握測(cè)定α-淀粉酶活力的實(shí)驗(yàn)操作。

二、實(shí)驗(yàn)原理

α-淀粉酶能將淀粉分子鏈中α-1,4葡萄糖苷鍵隨機(jī)切斷成長(zhǎng)短不一的短鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖，而使淀粉對(duì)碘呈藍(lán)紫色的特異性反應(yīng)逐漸消失，呈紅棕色，其顏色消失的速度和酶活力有關(guān)，可通過(guò)固定反應(yīng)后的吸光度計(jì)算其酶活力。

酶活力的定義：1g固體酶粉（或1mL液體酶），于60℃、pH＝6.0條件，1h液化1g可溶性淀粉，即為1個(gè)酶活力單位，以u/g（u/mL）表示。

三、實(shí)驗(yàn)器材

1. 實(shí)驗(yàn)材料：所購(gòu)α-淀粉酶的固體酶粉

2. 試劑及溶液

（1）原碘液稱取碘（I2）11g、碘化鉀（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，貯于棕色瓶中。

（2）稀碘液吸取原碘液2.00mL，加碘化鉀20g，用水溶解并定容至500mL，貯于棕色瓶中。

（3） 20g/L可溶性淀粉溶液稱取可溶性淀粉（以絕干計(jì)）2.000g，精確至0.001g，用水調(diào)成漿狀物，在攪動(dòng)下緩緩傾入70mL沸水中，然后，以30mL水分幾次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液并入其中，加熱至完全透明，冷卻，定容至100mL，此溶液需要當(dāng)天配制。

（4）磷酸緩沖液（pH＝6.0）稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）45.23g、檸檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解定容至1000mL。配好后用pH計(jì)校正。

3. 儀器和設(shè)備

（1）分光光度計(jì) 應(yīng)符合GB9721的有關(guān)規(guī)定

（2）恒溫水浴（60±0.2）℃。

（3）秒表

（4）試管 25mm×200mm

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 待測(cè)酶液的制備稱取酶粉1～2g，精確至0.0002g（或吸取液體酶1.00mL），先用少量的磷酸緩沖液溶解，并用玻璃攪拌棒搗研，將上清液小心傾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量緩沖液，如此搗研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度（將估計(jì)酶活力除以4，即酶活力應(yīng)在3.7～5.6u/mL范圍內(nèi)），搖勻。通過(guò)4層紗布過(guò)濾，濾液供測(cè)定用。（此溶液需要當(dāng)天配制）

2. 測(cè)定

（1）吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于試管中，加入緩沖液5.00mL，搖勻后，于（60±0.2）℃恒溫水浴中預(yù)熱5min。（小三角瓶中進(jìn)行）

（2）加入稀釋好的待測(cè)酶液1.00mL，立即記時(shí)，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)5min。

（3）立即吸取反應(yīng)液1.00 mL于稀碘液5.00 mL中，搖勻，并以稀碘液作空白，于660nm波長(zhǎng)下，用10mm比色皿，迅速測(cè)定其吸光度（A）。根據(jù)其吸光度查附表，求得測(cè)試酶液的濃度（c）。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算公式： X= c ×n

式中，X――樣品的酶活力（u/g，或u/mL）

c――測(cè)試酶液的濃度（u/mL）

n――樣品的稀釋倍數(shù)

所得結(jié)果表示至整數(shù)。

2. 平行試驗(yàn)相對(duì)誤差不得超過(guò)2%。

實(shí)驗(yàn)二 蛋白酶活性的測(cè)定

一,目的要求 學(xué)會(huì)蛋白酶活性的測(cè)定方法.

二,實(shí)驗(yàn)原理

蛋白酶在一定的溫度與pH條件下,水解酪素底物,產(chǎn)生含有酚基的氨基酸,在堿性條件下,將福林試劑還原,生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán),用分光光度法測(cè)定.

三,儀器,材料與試劑

1,苯酚試劑加水稀釋1倍左右,用NaOH標(biāo)定至1mol/L使用.盛在有色瓶中保存.

2,10%三氯醋酸溶液

3,0.4mol/L碳酸鈉溶液:稱取42.4g無(wú)水碳酸鈉,用水溶解,定容至1 000mL.

4,適當(dāng)pH緩沖液(供不同蛋白質(zhì)使用):例如0.02mol/L,pH7.5磷酸緩沖液.

5,2%酪蛋白溶液:稱取酪蛋白2g,用少量0.5mol/LNaOH溶液濕潤(rùn)后,用各種酶適宜的緩沖液稀釋,在沸水液中加熱溶解,冷卻后用相應(yīng)的緩沖液定容至100mL.

6,0.1%標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液:準(zhǔn)確稱取酪氨酸(預(yù)先在105°C干燥2h)0.1g,用0.2mol/L HCl溶解并定容至100mL.使用時(shí)再稀釋成不同濃度.

四,實(shí)驗(yàn)步驟

1,將標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液配成0~100ug/mL的各種不同溶液.分別吸收1mL,各加入0.4mol/LNa2CO3溶液5mL及福林試劑1mL,置于40°C顯色15min,分別測(cè)定OD680,以酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo),OD680為坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2,取酶液1mL,預(yù)熱至40°C,加入預(yù)熱的2%酪蛋白溶液1mL,于40°C反應(yīng)10min,反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入10%三氯醋酸溶液2mL,立即搖勻,靜置10min后過(guò)濾.取濾液1mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)相同的步驟,測(cè)定OD680.空白實(shí)驗(yàn)時(shí),先加三氯醋酸溶液,然后再加入底物和酶液,同樣測(cè)定OD680.

3,計(jì)算

在上述條件下,每分鐘催化酪蛋白水解生成1mg酪氨酸的酶量定義為1個(gè)活力單位.

酶活力(單位)= OD680 x Kx n /10

式中: OD680——在680nm波長(zhǎng)下,樣品測(cè)定與空白實(shí)驗(yàn)的光密度差;

K——常數(shù),有標(biāo)準(zhǔn)曲線得出,數(shù)值上等于OD680為1的時(shí)候所相當(dāng)?shù)睦野彼岬暮量藬?shù);

n——反應(yīng)液體積;

10——反應(yīng)時(shí)間為10min.

實(shí)驗(yàn)三、纖維素（CMC）酶活力的測(cè)定方法

一、原理

纖維素酶在一定的溫度和pH條件下，將纖維素底物（CMC，羧甲基纖維素鈉）水解，釋放出還原糖。在堿性、煮沸條件下，能將3,5-二硝基水楊酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物，其顏色的深淺與還原糖（以葡萄糖計(jì)）含量成正比。通過(guò)其在550nm測(cè)其吸光度，可得到還原糖生成量，計(jì)算出β－葡聚糖酶的酶活力。以此代表纖維素（CMC）酶的總酶活力。

酶活單位定義

在（40±0.2）℃、pH 4.2條件下，在1min內(nèi)水解羧甲基纖維素鈉底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1微克葡萄糖的還原糖的酶量，為1個(gè)酶活單位，以u(píng)/g(u/ml)表示。

二、試劑和溶液

　　除非另有規(guī)定，試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。

i. 羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）

中國(guó)醫(yī)藥公司上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)，分析純，在25℃,2%水溶液粘度300～800厘泊爾。

ii. 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液:

甲液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4.2H2O ）35.61 g, 用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。

乙液：稱取檸檬酸（C6H8O7.H2O）21.01 g，用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。.

使用溶液：取甲液414ml，加乙液586ml混合均勻，用pH計(jì)校正至pH為（4.2 ±0.05）,備用。

iii. 1%羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）溶液

稱取1g羧甲基纖維素鈉，精確至1mg，緩緩加入pH為4.2 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液80ml，水浴加熱至全部溶解。冷卻后用2M　HCL或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH到（4.2 ±0.05），攪拌均勻，定容至100ml，再用二層紗布過(guò)濾。此溶液在4oC冰箱貯存，有效期為3天。

iv. 3,5－二硝基水楊酸（DNS）試劑:

取酒石酸鉀鈉182g，溶于500ml蒸餾水中，加熱。于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3g，氫氧化鈉10g，苯酚5g，無(wú)水亞硫酸鈉5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，混勻，過(guò)濾，貯于棕色試劑瓶中，于暗處放置1周后使用。

　 :注：在黑色或棕色瓶中于室溫下貯存，該試劑最多穩(wěn)定6個(gè)月。

v. 1%(W/V)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液

稱取預(yù)先于（103±2）℃下干燥至恒重的葡萄糖1.0000 g，用蒸餾水溶解后定容至100 ml，即為1%濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

D.2.5葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液

分別吸取1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、　5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，制成每ml分別含葡萄糖200μg、400μg、600μg、800μg、1000μg、1200 μg的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

b) 儀器和設(shè)備

　除普通實(shí)驗(yàn)室儀器外，還應(yīng)有：

i. 恒溫水浴鍋(40±0.2) oC。

D.3.2 分光光度計(jì)

ii. 酸度計(jì)　精度±0.01pH 。

iii. 分析天平　感量0.1mg。

iv. 秒表或定時(shí)鐘。

c) 測(cè)定步驟

i. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按表D.1，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于各管中（每管號(hào)平平行3個(gè)樣），混勻。

將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于沸水浴中，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入蒸餾水10ml，混勻。用10mm比色杯，以空白管（對(duì)照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm處測(cè)吸光度。以葡萄糖量為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。線性回歸系數(shù)（r）應(yīng)在0.9990以上時(shí)方可使用（否則須重做）。對(duì)每個(gè)新配制的DNS溶液制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表D.1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

管　　號(hào)

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液

磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ml)

DNS試劑吸取量

(ml)

濃度（μg/ml）

吸取量（ml）

0

0.50

1.5

3.0

1

200

0.50

1.5

3.0

2

400

0.50

1.5

3.0

3

600

0.50

1.5

3.0

4

800

0.50

1.5

3.0

5

1000

0.50

1.5

3.0

6

1200

0.50

1.5

3.0

ii. 樣品的測(cè)定

1. 待測(cè)酶液的制備

固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱取2g－10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40－200ml蒸餾水，溶解后置40oC水浴浸提30min，用濾紙過(guò)濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間，下同）。液體酶：精確量取液體酶若干ml，根據(jù)樣品酶活力大小，直接用蒸餾水稀釋至適宜濃度，待測(cè)。

2. 操作程序

――取三支18×180mm試管（一支空白管。二支樣品管）。

――分別向三支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液0.50ml 。

――將三支試管放入（40±0.2）oC水浴中預(yù)熱5min，同時(shí)將測(cè)定底物（1%羧甲基纖維素鈉溶液）置同一溫度水浴中預(yù)熱5min。

――分別向二支樣品管中加入1.5ml　1%羧甲基纖維素鈉溶液，向空白管中加入3mlDNS試劑，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)10min，取出。

――迅速、準(zhǔn)確向二支樣品管中加入3ml DNS試劑，于空白管中加入1.5ml　1%羧甲基纖維素鈉溶液，搖勻。將三支試管同時(shí)放入沸水浴中，待水浴中的水重新沸騰時(shí)開(kāi)始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫。向三支試管中各加入10ml蒸餾水，混勻。

――以空白管（對(duì)照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm下，用10mm比色杯，分別測(cè)二支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過(guò)查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量。

d) 酶活力計(jì)算

按照下式（D.1）計(jì)算樣品的纖維素CMC酶的活力：

　　　　　A×V×N

X1＝ …………………………………………………(D.1)

0.5×W×10

式中：

　　　　　X1――――纖維素CMC酶活力，u/g??；

　　　　　A――――根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得（或從回歸方程計(jì)算出）的還原糖生成量，μg；

　　　　　V――――樣品提取時(shí)加入水的量（ml）；

　　　　　N――――樣品二次稀釋時(shí)的稀釋倍數(shù)；

0.5―――參與反應(yīng)的酶量（ml）；